分光光度技術的簡介

利用紫外光、可見光、紅外光和激光等測定物質的吸收光譜，利用此吸收光譜對物質進行定性定量分析和物質結構分析的方法，稱為分光光度法或分光光度技術，使用的儀稱為分光光度計，分光光度計靈敏度高，測定速度快，應用范圍廣，尤其是紫外/可見分光光度技術更是生物化學研究工作中*的基本手段之一。
1.紫外和可見光光譜
光譜
光是電磁波，可用波長”λ”表示，電磁波譜是由不同性質的連續波長的光譜所組成，對于生物化學來說，zui重要的波長區域是可見光和紫外光。
光的波長是二個相鄰的波峰之間的間隔。光的傳播是由相互垂直的電場分量”E”和磁場分量”H”所構成。
λ ＝ C/V
其中， λ-波長； C-光速； V-頻率，單位時間通過一個定點的波數。
光又可以看作是由具有能量的粒子所組成，這些粒子所具有的原能量”E”由下式算出：
E ＝ H·V
H-普朗克常數（ 6.624×10-27爾格·秒）； V-頻率。
紫外區可分為紫外（近紫外）和真空紫外（遠紫外）。由于吸收池（又稱樣品池、比色杯等）和光學元件以及氧氣能吸收小于190nm 波長的光，因此常規紫外測定集中在近紫外區，即 200nm～400nm。可見光區為400nm～800nm。
組成物質的分子均處于一定能態并不停地運動著，分子的運動可分為平動、轉動、振動和分子內電子的運動，每種運動狀態都處于一定的能級，因此分子的能量可以寫成：
E＝E0 E 平 E 轉 E 振 E 電
E0-分子內在的不隨分子運動而改變的能量； E 平--平動能，只是溫度的函數因此與光譜有關的能量變化是分子的轉動能量、振動能量和分子的電子能量。分子的每一種能量都有一系列的能級，能級不是任意的，而是具有量子化特征的，通常分子處于基態，當它吸收一定能量躍遷到激發態，則產生吸收光譜。分子轉動、振動和電子能級的躍遷，相應地產生轉動、振動及電子光譜。
按照量子力學原理，分子能態按一定的規律跳躍式地變化，物質在進射光的照射下，分子吸收光時，其能量的增加是不連續的，物質只能吸收一定能量的光，吸收光的頻率和兩個能級間的能量差要符合下列關系：
E＝E2- E1＝h
E1、E2分別表示初能態和終能態的能量，初能態與終能態之間的能量差愈大，則所吸收的光的頻率愈高（即波長愈短），反之則所吸收的光的頻率愈低（即波長愈長）。由于吸收是不連續的，因此在光的一定部位出現一系列吸收譜帶。由于分子轉動、振動及電子能級躍遷的能量差別較大，因此，它們的吸收光譜出現在不同的光譜區域。分子轉動能級級差小，△E＜0.05電子伏特（ev），分子轉動光譜的吸收出現在遠紅外或微波區。振動能級間的差別較大， E＝0.05~1.0ev，振動光譜出現在中紅外區。
電子能級的級差更大， E＝1~20ev，所以由電子躍遷得到的光譜出現在可見、紫外或波長更短的光譜區。
可見光、紫外光吸收光譜，是由于分子中較疏松的價電子被激發產生躍遷從而吸收光輻射能量形成的，即分子由基態變為激發態，電子由一個低能級的軌道（即成鍵軌道），吸收了光能量躍遷到高能級軌道（稱為反鍵軌道）。
與吸收光譜有關的三種是：
①二個原子的電子沿其對稱方向相互形成的共價鍵（即單鍵），稱σ 鍵， 構成σ 鍵的電子稱σ 電子，如C－C、C－H 鍵。
②平行于二個原子軌道形成的價鍵（即雙鍵），稱π 鍵，形成π 鍵的電子稱為π 電子，如C=C 鍵。
③未共享成鍵的電子，稱n 電子。
各種電子躍遷所需能量大小的順序是：

紫外吸收光譜主要是由于雙鍵電子，尤其是共軛雙鍵中的π 電子和未共享的電子對的激發所產生的。所以各種物質分子對紫外光的吸光性質取決于該分子的雙鍵數目和未共享電子對的共軛情況等。
表2－7 電子躍遷類型與紫外吸收波長（nm）關系